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Caspase 3/7 与 PI 联合检测的基本原理

Caspase 3/7 是细胞凋亡过程中的关键执行者，属于半胱氨酸蛋白酶家族。当细胞接收到凋亡信号后，上游的启动型Caspase会被激活，进而切割并激活下游的效应型Caspase（包括Caspase 3/7）。激活的Caspase 3/7能够特异性识别并切割底物DEVD序列（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸）。基于这一特性，研究人员开发了含有DEVD序列的荧光底物（如CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent）。这些底物在未激活状态下荧光微弱，一旦被Caspase 3/7切割，便会释放出强绿色荧光信号，从而标记出正在发生凋亡的细胞。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种膜不通透性的DNA染料，无法进入活细胞或早期凋亡细胞。当细胞膜完整性丧失（如晚期凋亡或坏死细胞），PI可进入细胞核与DNA结合，产生强红色荧光。因此，PI常用于区分死亡细胞。

联合使用时，Caspase 3/7荧光底物标记凋亡细胞（绿色），PI标记死亡细胞（红色），实现凋亡不同阶段的精准区分。

实验方案设计与优化

样本制备需根据细胞类型调整。贴壁细胞建议用酶消化法收集，避免刮刀造成的膜损伤。悬浮细胞可直接离心收集。细胞密度控制在1×10^6 cells/mL，密度过高会导致荧光信号重叠。

染料工作浓度需通过预实验确定。Caspase 3/7底物常用浓度为1-5 μM，PI常用1-2 μg/mL。浓度过高会引起非特异性染色。染色时间在37℃避光环境下进行15-30分钟，时间过长可能增加假阳性。

设置对照组至关重要。空白对照（未染色细胞）用于调节电压；单阳对照（仅加Caspase底物或PI）用于补偿调节；诱导凋亡阳性对照（如用1 μM星形孢菌素处理4小时）验证实验体系。

流式细胞术检测策略

上机前用300目滤网过滤细胞，减少堵管风险。采用488 nm激光激发，Caspase 3/7绿色荧光用FITC通道（530/30 nm滤片）检测，PI红色荧光用PE通道（585/42 nm滤片）检测。

电压设置使阴性群体位于10^0-10^1区间。由于Caspase 3/7与PI荧光光谱存在部分重叠，必须进行荧光补偿。用单染样本调节，确保双阳群体信号准确。

数据分析采用四象限图：左下象限为活细胞（颁补蝉辫补蝉别-/笔滨-）；右下象限为早期凋亡细胞（颁补蝉辫补蝉别+/笔滨-）；右上象限为晚期凋亡/坏死细胞（颁补蝉辫补蝉别+/笔滨+）；左上象限可能为坏死细胞（颁补蝉辫补蝉别-/笔滨+）。

常见问题与解决方案

背景荧光过高往往由染料浓度过高或孵育时间过长导致。降低染料浓度或缩短孵育时间可改善。同时确认洗涤步骤充分，去除未结合染料。

早期凋亡细胞比例低可能源于诱导时间不足。延长诱导时间或增加诱导剂浓度。确认试剂活性，新购试剂需进行效能验证。

笔滨阳性细胞过多提示膜损伤严重。检查细胞制备过程是否温和，避免反复离心或剧烈吹打。使用新鲜配制的笔滨溶液，避光保存。

荧光衰减影响结果稳定性。上机检测需在染色后1小时内完成，避免荧光淬灭。必要时添加抗淬灭剂。